pcr分析仪怎么校准，pcr分析仪仪器校准步骤

pcr分析仪仪器校准步骤

１、荧光定量PCR仪校准现状

相对于传统PCR仪，荧光定量PCR仪的影响因素更为复杂，主要因素包含化学试剂、温度模块的温度因数、顶盖温度因数、镜头、反光镜和光路通道、荧光接收器的敏感度、机械组成部分、荧光信号处理软件的阈值设定，如基线，基线设定，Ｓ／Ｎ比例探测等，这就为荧光定量PCR仪的校准带来了巨大的挑战。

国内校准机构目前针对荧光定量PCR仪的校准主要分为两种情况：

一种是仅对荧光定量PCR仪的温场部分进行校准，这种方法无法对荧光定量PCR仪光学部分进行校准，所获得的结果不能对荧光定量PCR仪的性能进行全面评估；

另外一种方法是利用化学试剂对荧光定量PCR仪的进行荧光检测，这种方法同样存在极大缺陷。首先采用化学方法对定量PCR仪荧光系统进行校准，无法溯源到任何公认的标准，不具备溯源性。其次，梯度稀释试剂的过程中由于人为操作会引入一定的误差，误差值可能较大，直接影响到最终的检测结果。最重要的是，采用这种方法进行校准，无法说明荧光定量PCR仪的温度和荧光对最终定量结果的影响关系，误差多少及误差来源等。

随着定量PCR仪的应用越来越广泛，使用者迫切需要对荧光定量PCR仪的性能进行评估。在现有检测手段无法满足需求的情况下，荧光定量PCR仪使用者普遍采用两种方式自行对仪器状态进行判断，一种是使用生物试剂测试盘这种检测方法和采用已知浓度的质粒ＤＮＡ标准物质对样本线性误差进行校准的方法都属于化学方法，这种方法仅能够针对孔与孔间的组合线性进行测量，所得结果仅能代表PCR仪孔与孔间的平均结果，不能代表单孔的线性，无法真实反映仪器的性能。另一种方法是采用多台不同厂家或型号定量PCR仪实验比对的方式来比较不同仪器间的系统误差，判断系统误差是否在临床接受范围内。这种方法既不具备溯源性，又需要对单个项目进行实验比对，成本较高。

影响定量PCR仪结果重复性的２个主要原因是边缘效应和实验误差，而边缘效应是由于光路设计缺陷和控温模块缺陷导致的。如果光路设计存在缺陷，会导致PCR仪样品槽的边缘孔和中间孔光程存在差异，不同反映孔间荧光基团获得的激发光能量存在差异，最终影响实验结果。同时，加热模块的空间温差同样会导致这种边缘效应，研究表明，孔间温差的微小差别可能在基因扩增的过程中被指数级放大，最终影响实验结果。此外，光路设计缺陷和孔间温差的存在还会直接影响到熔解曲线的结果，使得不同仪器对熔解曲线的分辨率存在明显差异。在通过熔解曲线检测突变或进行单核苷酸多态性分析时，这种影响会导致无法成功区分突变基因或误判突变基因。

因此，对定量PCR仪更加全面科学的校准方式是采用可溯源物理手段同时对荧光定量PCR仪的温度部分和光学部分进行校准，并分析二者之间的联系，以保障实验结果的准确性。

２、定量PCR仪光学校准系统

基于上述定量PCR仪校准需求，本文采用Cyclertest3Doptical定量PCR仪光学校准系统对定量PCR仪的温场和荧光系统进行全面校准。系统在原有的PCR仪温度校准系统基础上运用可溯源光谱理论，将温度和荧光检测相结合，模拟定量PCR仪试验，不仅可以对温度模块、上盖温度进行检测，还能同时对荧光系统进行检测，并分析而二者的相关性，更准确地确定定量PCR仪误差及误差来源。

前端传感器示意图检测系统镶嵌经校准并可用光谱仪溯源的发光LEG，通过给定电流量的不同会产生不同区强度的荧光模拟标准荧光激发，并通过对荧光激发部分的温度控制。

这种设计避免了光谱的漂移，保证LEG的激发光在运行过程中保持绝对的同一水平，这种采用物理手段进行检测，避免了人为操作引入的误差，更加准确。这种荧光检测方法通过了国际认证，运用了可溯源光谱理论，可溯源温度计量来对荧光定量PCR进行*的检测，系统根据溯源性、可靠性和准确性。

系统温度部分可以对定量PCR仪的温度准确度、孔间温差、实时升温速率、实时降温速率、温度过冲、温度持续时间、上盖温度进行校准。荧光部分可以对定量PCR仪的Ｃｑ（Ｃｔ）相差值、精确度、荧光饱和值、荧光线性、熔解曲线精确度及一致性，熔解温度的比例关系及线性灵敏度等进行检测。

以上就是pcr分析仪仪器校准步骤，有需求的朋友不妨联系深圳精宇航检测。